维生素B_1对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究

第４９卷第４期　厦门大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．４９　Ｎｏ．４　２０１０年７月　Ｊｕ１．２０１０　维生素Ｂ１对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究　陈桂霞，胡泳华，王　伟　，邱　凌，宋康康，陈清西　（厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建厦门３６１００５）　摘要：报道了维生素Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活力的影响以及抑制作用机理．研究结果表明，维生索Ｂｌ　（Ｖｉｔ　Ｂ１）对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用．测定导致单酚酶活力和二酚酶活力下降５Ｏ　的抑制剂　浓度（ｊＧ。）分别为ｌ５和２０　ｍｍｏｌ／Ｌ．Ｖｉｔ　Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶的迟滞时间有明显的延长效应，２１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｖｉｔ　Ｂ　使得单酚酶的迟滞时间从５２　ｓ延长到２７７　ｓ．Ｖｉｉ　Ｂ　对二酚酶的抑制作用表现为竞争性抑制类型，测定抑制常数（Ｋ－）为　ｌ１．７　ｍｍｏｌ／Ｌ．　关键词：酪氨酸酶；单酚酶活性；二酚酶活性；维生素Ｂ　；抑制机理　中图分类号：Ｑ　３５６．ｉ　文献标识码：Ａ　文章编号：０４３８—０４７９（２０１０）０４—０５５８　０３　酪氨酸酶（ＥＣ　１．１４．１８．１）是生物体合成黑色素　等色素的关键酶［１≈］，抑制其活力即可抑制黑色素的生　成，具有重要的应用前景．我们在研究该酶抑制剂过程　１．２　方　法　蘑菇酪氨酸酶的活力测定参考文献［４３，单酚酶　活力测定以２．０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ一酪氨酸为底物，二酚酶活　力测定是以０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ—ＤＯＰＡ为底物，酶的终质　量浓度为６．６７／￣ｇ／ｍＬ．测定仪器为ＵＶ－６５０分光光　度计，在３０。Ｃ恒温下，监测４７５　ｎｍ的光密度值随反　中发现，维生索Ｂ　（Ｖｉｔ　Ｂ　）对该酶的单酚酶活性与二　酚酶活性均有明显的抑制作用．Ｖｉｔ　Ｂ。即硫胺素是参　与体内糖及能量代谢的重要维生素，具有抗氧化作用，　除了保护心、肝、肾外，还有减轻色素沉着的增白作　用Ｌ３］．其缺乏可导致消化、神经和心血管诸系统的功能　紊乱．关于Ｖｉｔ　Ｂ。在抗酪氨酸酶活性方面，国内外尚　未有报告，我们实验中发现Ｖｉｔ　Ｂ　具有新的生物学功　能．本文报道了Ｖｉｔ　Ｂ　对酪氨酸酶抑制效应及其作用　应时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力．产物　的消光系数按３　７００　Ｌ／（ｍｏ１．ｃｍ）计算．　Ｖｉｔ　Ｂ　对酶活力的效应通过测定加入不同浓度的　效应物后酶的剩余活力来判断，对照组加入３．３３　（体积比）ＤＭＳＯ以排除ＤＭＳＯ对实验结果的影响．　机理，提出了抑制剂和酶分子问结合作用的分子模型，　为酪氨酸酶抑制剂的设计和预防皮肤褐变的分子机理　提供了理论依据．　Ｖｉｔ　Ｂ　对酶的抑制作用通过改变加入的酶量，测定含　不同浓度效应物下，酶活力与酶量的关系来判断．酶的　抑制作用类型采用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ双倒数作图，通　过比较酶催化反应的动力学参数Ｋ　和　的变化进　行判断［５］．　１材料与方法　１．１　材料　２　实验结果　２．１　Ｖｉｔ　Ｂ。对蘑菇酪氨酸酶单酚酶活力的影　响　以Ｖｉｔ　Ｂ　为效应物，以Ｌ—Ｔｙｒ为底物测定蘑菇酪　氨酸酶单酚酶催化反应的进程曲线（图１）．反应初始　时，产物的形成量缓慢地上升，到一定时间后呈直线上　升，反应体系达到恒定的斜率，说明反应已达到稳定　Ｖｉｔ　Ｂ　和二甲亚砜（ＤＭＳＯ）为Ｓｉｇｍａ化学公司　产品；Ｌ一多巴（Ｌ—ＤＯＰＡ）和Ｌ一酪氨酸（Ｌ—Ｔｙｒ）为　Ａｌｄｒｉｃｈ化学公司产品；蘑菇酪氨酸酶购于Ｓｉｇｍａ化　学公司，酶的比活力为６　６８０　Ｕ／ｍｇ．　收稿日期：２００９－１２－０６　基金项目：国家自然科学基金（３０５７０４０８）；滨海湿地生态系统教育　部重点实验室（厦门大学）开放基金；福建省重点科技项　目（２００７Ｎ００５１）　态．直线部分外推得到横轴的截距为迟滞时间［６］．结果　表明，随着Ｖｉｔ　Ｂ。的浓度增大，单酚酶稳定态活力下　降，迟滞时间则明显延长，说明Ｖｉｔ　Ｂ。对蘑菇酪氨酸　＊现工作单位：漳州师范学院生物科学与技术系　＊＊通讯作者：ｃｈｅｎｑｘ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　酶的单酚酶活性有显著的抑制作用．分别以酶稳定态　第４期　陈桂霞等：维生素Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究　・５５９・　活力和迟滞时问对Ｖｉｔ　Ｂ　浓度作图，结果见图２．随着　Ｖｉｔ　Ｂ。的浓度增大，酶稳定态活力呈指数下降（图２线　１），测定导致酶稳态活力下降至５Ｏ％时的抑制剂浓度　（ＩＣ。。）为１５　ｍｍｏｌ／Ｌ．而随着Ｖｉｔ　Ｂ　浓度的增大，酶反　应的迟滞时间指数增大（图２线２）．当Ｖｉｔ　Ｂ　浓度为　２１　ｍｍｏｌ／Ｌ时，迟滞时间由５２　Ｓ增大到２７７　Ｓ．说明　Ｖｉｔ　Ｂ　通过降低酶的稳定态活力和延长迟滞时间而抑　制酪氨酸酶单酚酶的活力．　ｔ／ｓ　图１　Ｖｉｔ　Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶作用的浓度效应　曲线ｌ～８　Ｖｉｔ　Ｂ１为０，３，６，９，１２，１５，１８，２１　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｆｉｇ．１　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｃｕｒｖｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｐｈｅｎｌａｓｅ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｂｙ　Ｖｉｔ　Ｂ１　ｑ／（ｍｍｏｌ　Ｌ　）　图２　Ｖｉｔ　Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶的稳定态（１）和迟滞　时间（２）的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｖｉｔ　Ｂ１　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ（１）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌａｇ　ｔｉｍｅ（２）ｏｆ　ｍｏｎｏｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙ—　ｒｏｓｉｎａｓｅ　２．２　Ｖｉｔ　Ｂ。对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影　响　以Ｌ—ＤＯＰＡ为底物，测定二酚酶活力，酶反应的　进程曲线为一条通过原点的直线，直线的斜率即为酶　活力．在反应体系中加人Ｖｉｔ　Ｂ　后，直线的斜率下降，　说明Ｖｉｔ　Ｂ　对二酚酶活力也有抑制作用，其对二酚酶　活力的浓度效应如图３所示，测定导致酶活力下降一　半所需的抑制剂浓度（ＩＧ。）为２０　ｍｍｏｌ／Ｌ．　２．３　Ｖｉｔ　Ｂｌ对二酚酶的抑制动力学研究　在固定底物浓度的测活体系中，改变酶量，测定不　同浓度效应物对该酶催化Ｌ—ＤＯＰＡ氧化活力的影响．　酶经Ｖｉｔ　Ｂ　作用后的酶活力对酶量作图得到一组通　过原点的直线，随着效应物浓度的增大，直线的斜率降　低．说明Ｖｉｔ　Ｂ　对酶的抑制作用属于可逆过程，即抑制　剂是通过抑制酶活力，降低酶催化效率，而非通过导致　有效的酶量减少而导致酪氨酸酶二酚酶活力的下降．　在测活体系中固定酶量不变，改变底物Ｌ—ＤＯＰＡ　的浓度，研究Ｖｉｔ　Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作　用类型．采用以Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ双倒数作图，得到一　组相交于纵轴的直线（图４ａ）．说明Ｖｉｔ　Ｂ　不影响酶促　反应的最大反应速度Ｖ　值，只影响酶促反应的米氏　１２０　１００　８０　三　琶６０　喜　嚣　虿４ｏ　２Ｏ　０　２Ｏ　４ｏ　６０　８Ｏ　ｌ０ｏ　ｃ／（ｍｍｏｌ・Ｌ。　）　图３　Ｖｉｔ　Ｂ　对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制效应　Ｆｉｇ．３　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｖｉｔ　Ｂ１　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉ－　ｔｙ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　常数（Ｋ　），使Ｋ　值增大，其抑制效应为竞争型抑制　类型，Ｖｉｔ　Ｂ　同底物竞争地与游离酶（Ｅ）结合．二次作　图（图４ｂ），求得抑制常数Ｋ。为ｌ１．７　ｍｍｏｌ／Ｌ．　３　讨　论　酪氨酸酶能够催化单酚产生邻位二酚（单酚酶活　性），邻位二酚进一步氧化成为相应的醌（二酚酶活　力），进而生成一系列引起褐化的色素类物质［６］．因　此，对酪氨酸酶活力的抑制，既可以通过单酚酶的迟　滞时间延长和稳定态活力的降低，也可以通过二酚酶　的活力的抑制来实现．本文的实验结果显示，Ｖｉｔ　Ｂ　对酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活力均有抑制作用，其　抑制效应表现为可逆抑制机理，Ｖｉｔ　Ｂ　可以可逆地和　底物竞争与游离酶的结合，抑制类型表现为竞争型。　・５６０・　厦门大学学报（自然科学版）　２０１０经　为安全．本文从理论上阐述了Ｖｉｉ　Ｂ　减轻色素沉积的　０３０　。　ｏ２５　ｆ　机理，对Ｖｉｔ　Ｂ　作为美白药物的应用提供了理论基础．　‘重０２０　ｏＪ５　＝　参考文献：　［１］陈清西，宋康康．酪氨酸酶研究进展［Ｊ］．厦门大学学报：　自然科学版，２００６。４５（５）：７３１－７３７．　０．１０　∞５　．——　［２］　陈桂霞，邱凌，宋康康，等．桑黄素对蘑菇酪氨酸酶的抑制　Ｏ　２Ｏ　４０　作用ＥＪ］．厦门大学学报：自然科学版，２００６，４５（３）：４２４—　４２７．　ｑ／（ｍｍｏｌ・Ｌ　）　ＯＤ　１．０　２０　．２０　．Ｌ０　ｃｙ（ｍｍｏｌ　－Ｌ１　图４　Ｖｉｔ　Ｂ１对酪氨酸酶二酚酶抑制类型的判断　［３］沈同，王镜岩．生物化学［Ｍ］．２版．北京：高等教育出版　社，１９９１：３１７－３１８．　曲线１～５对应抑制剂浓度分别为０，１０，２０，３０，４０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｆｉｇ．４　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｏｆ　Ｖｉｔ　Ｂ１　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　［４］Ｚｈｕａｎｇ　Ｊ　ｘ，Ｌｉ　ｗ　Ｇ，Ｑｉｕ　Ｌ，ａｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｅ—　ｆａｚｏｌｉｎ　ａｎｄ　ｃｅｆｏｄｉｚｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙｒｏｓｉ－　ｎａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，２００９，２４：２５１—２５６．　［５］Ｃｈｅｎ　Ｑ　Ｘ，Ｓｏｎｇ　Ｋ　Ｋ，Ｑｉｕ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ｂｙ　ｐ－ａｌｋｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄｓ　，ｌＪ］．Ｆｏｏｄ　Ｖｉｔ　Ｂ１是人体必需的维生素之一．在体内，Ｖｉｔ　Ｂ　以辅　酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用，还　Ｃｈｅｍ，２００５，９１：２６９—２７４．　［６］　Ｚｈｕ　Ｙ　Ｊ，ｏｎｇ　ＳＫ　Ｋ，Ｌｉ　ｚ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉ—　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓ・－ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ　ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒ－・　与保持神经传导心血管、消化等系统和皮肤的正常功　能有关．Ｖｉｔ　Ｂ　的制剂常用来做为抗脚气病或抗神经　炎症的药物使用，本文的研究结果显示，Ｖｉｔ　Ｂ　还对酪　ｂａｚｏｎｅ［Ｊ］．Ｊ　Ａｇｒｉ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ。２００９．５７：５５１８—５５２３．　［７］宋康康，邱凌，黄璜，等．熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨　酸酶抑制作用［Ｊ］．厦门大学学报：自然科学版，２００３。４２　（６）：７９１—７９４．　氨酸酶有一定的抑制作用，尽管其抑制效果较目前常　用的美白添加剂熊果甙［７］（ＩＣ５。一５．３　ｍｍｏｌ／Ｌ）与曲　［８］黄璜，宋康康，陈清西．曲酸作为化妆品添加剂的增自机　酸Ｌ８］（ＩＣ５。一Ｏ．０２　ｔＬｍｏｌ／Ｌ）相比较弱，但由于Ｖｉｔ　Ｂ　可　以在体内正常代谢，因此与熊果甙和曲酸相比，使用更　理研究ｌ－ｊ］．厦门大学学报：自然科学版，２００３，４２（５）：６５２－　６５６．　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｍｕｓｈｒｏｏｍ　Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ　ＣＨＥＮ　Ｇｕｉ—ｘｉａ，ＨＵ　Ｙｏｎｇ—ｈｕａ，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＱＩＵ　Ｌｉｎｇ，　Ｓ０ＮＧ　Ｋａｎｇ—ｋａｎｇ。Ｃ　Ｈ　ＥＮ　Ｑｉｎｇ—ｘｉ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃｏａｓｔａｌ　ａｎｄ　Ｗｅｔｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ　３６１００５　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ。ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｎｄ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｔｙｒｏｓｉ—　ｎａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ】ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｂｏｔｈ　ｍｏｎｏｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎ—　ｚｙｍｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｌｅａｄ　ｔＯ　５０　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　１５　ａｎｄ　２０　ｍｍｏｌ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｖｉｔａ—　ｍｉｎ　Ｂｌ　ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ　ｔｈｅ　ｌａｇ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｌａｇ　ｔｉｍｅ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　５２　ｓｅｃｏｎｄｓ　ｉｎ　ｉｔｓ　ａｂｓｅｎｅｅ　ｔＯ　２７７　ｓｅｃｏｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　２１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ａｎｄ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔＯ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ－ｔｙｐｅ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔｓ（ＫＩ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔＯ　ｂｅ　１１．７　ｍｍｏｌ／Ｌ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ；ｍｏｎｏｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．