%bf照射灭活结核分枝杆菌的实验效果分析

主园堕瘥苤查！！！！生！旦筮ｉ！鲞箜！塑鱼垒ｉ里』垒！坐坠！！望！垒！ｇ！坠垫！ｉ！ｙ！！！；！！堕！：！・短篇论著・热灭活和紫外线照射灭活结核分枝杆菌的实验效果分析赖赛麟李海成王威孙毅凡郭卉欣陈涛江勇钱明江振友周琳钟球我国卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中结核分枝杆菌被列为第二类病原微生物（危害程度为Ⅲ级），属高致病性病原微生物口一。实验室研究课题中，大部分涉及到结核分枝杆菌的操作，实验室生物安全是首先要解决的问题。至今，已有一些关于实验室工作人员患结核病的报道，其中呼吸道吸入感染是实验室感染的最主要类型［２］。根据传染病发生必须存在的３个条件：传染源、传播途径和易感者。在实验操作中如果做好传染源的控制，如避免产生活菌气溶胶、有效灭活细菌等，实验室生物安全就有了最根本的保障。本实验探讨了实验室结核分枝杆菌传染源控制中的热灭活和紫外线照射灭活方法的效果，为保障生物安全提供参考依据。材料和方法一、实验材料１．实验菌株：６株结核分枝杆菌：ＢＣＧ：牛结核分枝杆菌；Ｈ３７Ｒａ：结核分枝杆菌减毒株；Ｈ３７Ｒｖ：结核分枝杆菌标准株；Ｓｅ：临床分离敏感菌株；ＭＤＲ：临床分离耐多药菌株；ＸＤＲ：临床分离广泛耐药菌株。上述菌株均由广东省结核病控制中心提供，均已经过对硝基苯甲酸（ＰＮＢ）、噻吩一２～羧酸肼（ＴＣＨ）鉴别培养基进行菌群初筛鉴定为结核分枝杆菌，并经过了基因分型鉴定和药敏鉴定为相应菌株。２．改良罗氏固体培养基：由广东省结核病控制中心制作提供。３．比浊仪：法国ｂｉｏＭ６ｒｉｅｕｘ（生物梅里埃）公司生产的ＤｅｎｓｉＣＨＥＫＰｌｕｓ比浊仪。４．生物安全柜：新加坡Ｅｓｃｏ公司生产的Ｌａｂｃｕｈｕｒｅ２级生物安全柜。５．电热仪：杭州奥盛仪器有限公司生产的干式恒温器。６．紫外线灯：新加坡ＥｓｃｏＬａｂｃｕｈｕｒｅ２级生物安全柜内置３０Ｗ紫外线灯，距离工作台面约７０ｃｍ，寿命在有效期内，使用前已用７５％乙醇纱布擦拭清洁。７．３７℃培养箱：上海一恒科技有限公司生产的ＬＲＨ系列生化培养箱。基金项目：国家“十二五”科技重大专项（２０１２ＺＸｌ０００４９０３；２０１３ＺＸｌ０００３００１）作者单位：５１０６３０广州，暨南大学医学院微生物与免疫教研室（赖赛麟、孙毅凡、江振友）；广东省结核病控制中心广东省“十二五”结核病防治转化医学重点实验室（李海成、郭卉欣、陈涛、江勇、钱明、周琳、钟球）；广东省佛山市第四人民医院检验科（王威）通信作者：钟球，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｑｉｕ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｒｎ万方数据二、实验方法１．制备菌悬液：６株细菌已在改良罗氏培养基培养５周，ｍｇ／ｒｎｌ，其余两个浓度为１０～ｍｇ／ｍＩ、１０１ｍｇ／ｍｌ菌悬液在此基础上依次加ＰＢＳ稀释制备。２．加热灭活：实验在ＥｓｃｏＬａｂｃｕｌｔｕｒｅ２级生物安全柜中ｍｌ至有螺纹盖的２ｍ１离心管（ＥＰ管）中，转移至已设好温度的电热仪孔中，加热至不同时间取出，３．紫外线照射灭活：实验在ＥｓｃｏＬａｂｃｕｌｔｕｒｅ２级生物安ｍｌ至６孔培养板，开盖ｃｍ，照射至不同４．结果观察记录：在经灭活处理后培养的第４周，观察实际菌落数。（３）菌落数＞５０个，生长面积≤１／４记录为“＋”；１／４＜生长面积≤１／２记录为“＋＋”；１／２＜生长面积≤３／４记录为“＋＋＋”；生长面积＞３／４记录为“＋＋＋＋”∞一。记录结果为２支罗氏培养基表面生长菌落的平均值。结果一、热灭活６株菌株３个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，ＰＢＳ阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长。在加热温度、时问相同的条件下，随着灭活对象菌悬液浓度的增大，细菌的残存数呈增多趋势；在菌液浓度、加热时间相同的情况下，随着加热温度的增大，细菌的残存数呈减少趋势；在菌液浓度、加热温度相同的条件下，随着加热时间的增加，细菌的残存数呈减少趋势。在温度≥８０℃，加热时间≥１０ｒａｉｎ的条件下，６株菌株１０～、１０～、１００ｍｇ／ｍｌ３个浓度１ｍ１菌悬液里的细菌可以被有效灭活（表１）。用接种环分别刮取菌株纯培养物至６个磨菌器中，用巴氏管加入无菌１０％吐温一８０的水溶液３滴，研磨后加入无菌磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）稀释，转移至一塑料试管经比浊仪测量，根据读数稀释为１００操作。吸取菌悬液１立即将处理后的菌悬液用１０肛１标准接种环各接种３环到２个改良罗氏固体培养基斜面，设立ＰＢＳ阴性对照，培养基空白对照和各菌悬液阳性对照，放３７℃培养箱培养８周，实验按菌液浓度分批进行。全柜中操作，ＢＳＬ－２负压实验室内的温度为２２℃，相对湿度为２４％。吸取各菌株的菌悬液各１置安全柜内置的紫外线灯下，垂直距离７０时间终止照射，将照射后的菌悬液用１０弘ｌ标准接种环各接种３环到２支改良罗氏固体培养基斜面，设立ＰＢＳ阴性对照，培养基空白对照和各菌悬液阳性对照，放３７℃培养箱培养８周，实验按菌液浓度分批进行。记录培养基斜面的残存菌落生长情况，第８周观察记录阴性结果：（１）无菌落生长记录为“一”。（２）菌落数≤５０个记录・６２２・史垦堕瘥苤查！！！ｉ笙！旦箜！！鲞筮！塑堡垒垫』垒坠生坚坠望！垒望ｇ！墅！！！！！ｙ！！：！§：塑壁：！表１不同加热时间各菌株１０、１０～、１００ｍｇ／ｍｌ３个菌液浓度１ｍｌ菌悬液经不同温度热灭活的结果１０ＢＣＧＨ３７ＲａＨ３７ＲｖＳｅ一一２２７１１３４８—１一一２一一一一１＋＋＋＋１３～１１０一５０一一一～一一一一１一一一一一一ＭＤＲＸＤＲ２０ＢＣＧＨ３７ＲａＨ３７ＲｖＳｅ＋＋＋１一一＋＋＋＋＋＋一４６一一６１３２一一一一一１一一一一一一一一一一１４７ＭＤＲＸＤＲ３０ＢＣＧＨ３７ＲａＨ３７Ｒｖ＋＋一一一一一一一一一一～一～一一一一一一６＋＋８一一一一一一一一一一一一～一～一一Ｓｅ————————————————————————————ＭＤＲＸＤＲ一１一２５６５一一一一一～一一一一一一一一一一一一～一一一注（１）同时设立的各菌株各浓度菌液阳性对照结果为“＋＋＋＋”，ＰＢＳ阴性对照及培养基空白对照结果为“一”。（２）在经灭活处理后培养的第４周，观察记录培养基斜面的残存菌落生长情况，第８周观察记录阴性结果：①无菌落生长记录为“一”。②菌落数≤５０个记录实际菌落数。③菌落数＞５０个，生长面积≤１／４记录为“＋”；１／４＜生长面积≤１／２记录为“＋＋”；１／２＜牛长面积≤３／４记录为“＋＋＋”；生长面积＞３／４记录为“＋＋＋＋”。记录结果为２支罗氏培养基表面生长菌落的平均值二、紫外线照射灭活６株菌株３个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，ＰＢＳ阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长。在紫外线照射距离、照射时间相同的条件下，随着菌液浓度的增大，细菌的残存数呈增加的趋势；在紫外线照射距离、菌液浓度相同的条件下，随着照射时间的增加，细菌的残存数呈减少的趋势；在照射距离为７０ｃｍ，照射时间≥４０ｍｉｎ的条件下，６株菌株１０一、１０～、１００ｍｇ／ｍｌ３个菌液浓度１ｍ１菌悬液里的细菌可以被紫外线有效灭活（表２）。表２不同菌株１０～、１０～、１００ｍｇ／ｍｌ３种菌液浓度１ｍ１菌悬液经紫外线照射的灭活结果ＢＣＧＨ３７Ｒａ一ｌ２２９３３——一１１——１一～一一一一一一一一一一一一１一１１一一～Ｈ３７Ｒｖ一１１一一一一一一Ｓｅ——————————————————————————————ＮＤＲＸＤＲ一一１１一一一一～一一一一一一一～一一一一一一一一一一一一一注（１）同时设立的各菌株各浓度菌液阳性对照结果为“＋＋＋＋”，ＰＢＳ阴性对照及培养基空白对照结果为“一”。（２）在经灭活处理后培养的第４周，观察记录培养基斜面的残存菌落生长情况，第８周观察记录阴性结果：①无菌落生长记录为“一”。②菌落数≤５０个记录实际菌落数。③菌落数＞５０个，生长面积≤１／４记录为“＋”；１／４＜生长面积≤１／２记录为“＋＋”；１／２＜生长面积≤３／４记录为“＋＋＋”；生长面积＞３／４记录为“＋＋＋＋”。记录结果为２支罗氏培养基表面生长菌落的平均值万方数据主垦堕窭苤查！！！！至！旦筮！！鲞筮！塑ｇｈ堕』垒坐ｉ！！！！望！垒！墨！生；！！；！ｙ！！：ｉ！！堕！：！讨论首先，本灭活实验研究中同时设立的６株菌株３个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，ＰＢＳ阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长，保证了实验结果准确地反映灭活处理的效果。一、关于影响热灭活结核分枝杆菌效果的因素分析在针对结核分枝杆菌的分子生物学水平的实验操作前，如菌种分子鉴定、基因分型及耐药基因分析等，必须先对培养物或临床样本进行确切灭活。目前的灭活方法主要是热灭活法，但温度和时间各不相同，最常见的方案是８０℃，灭菌３０ｍｉｎ：…，但也有文献指出这个简单的８０℃灭活方案的重复性依然有争议一“。本次热灭活实验设计了温度梯度、时间梯度和菌液浓度梯度进行了探讨，从表１的结果数据来看，８０℃灭活方案的有效性得到了支持。但是在６０℃、７０℃灭活方案中，在加热温度、时间相同的条件下，随着灭活对象菌悬液浓度的增大，细菌的残存数呈增多趋势。因此，必须考虑到菌液浓度因素的影响，如果菌液浓度继续增大，甚至远超出本次实验１００ｍｇ／ｍｌ的范围，８０℃的灭活方案是否也会出现残存的活菌？这是个值得进一步研究的问题，可能也是８０℃灭活方案还具有争议性的问题所在。另一方面，从表１还可以看到：在菌液浓度、加热时间相同的情况下，随着加热温度的增大，细菌的残存数呈减少趋势；在菌液浓度、加热温度相同的条件下，随着加热时间的增加，细菌的残存数呈减少趋势。所以，笔者建议：在不影响后续分子生物学实验的前提下，宜提高灭活温度或者延长灭活时问，以最大程度地降低生物安全风险。二、关于影响紫外线照射灭活结核分枝杆菌效果的因素分析本次紫外线照射灭活实验只设计了时间梯度和菌液浓度梯度，解读表２结果数据，灭活效果影响因素跟热灭活实验有相似之处：延长作用时间会增强灭活效果，菌液浓度的增大会减弱灭活效果。紫外线消毒有一个特别需要注意的特点是紫外线的穿透力弱，任何可以阻挡紫外线穿透的东西都会减弱灭活效果，如空气湿度、菌液厚度，等等。因此，生物安全柜每次紫外线消毒前应先用能有效杀灭结核分枝杆菌的７５％乙醇擦拭污染的工作台面，双管齐下，以最大程度地灭活污染台面的活菌。另外，根据大量文献报道，用紫外万方数据线对物体表面进行消毒时，灯管距物体表面的距离一般不超过１ｍ，照射时间一般不少于３０ｒａｉｎ［引。本次实验在照射距离为０．７ｍ的条件下，照射时间达到４０ｍｉｎ才能检测不出残存的活菌，与文献报道相似。其实，紫外线对结核分枝杆菌的杀菌效能，周维新：６ｊ早有研究。结核分枝杆菌对紫外线敏感，室内空气和物体表面可直接照射部分，紫外线消毒效果肯定有效旧：。使用紫外线灭菌装置进行物品表面消毒时，灯管距离物体表面不得超过ｌｍ，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量，使用中灯管的照射强度不得低于７０ｐＷ／ｃｍ２；使干燥，温度低于２０℃或高于４０℃，相对湿度大于６０％时应因为结核分枝杆菌是高致病性、可以经呼吸道传染的病实验只能模拟物体表面受菌液污染，局限于用生物安全柜内置的紫外线灯进行。灯管离工作台面垂直照射距离约７０ＣＴＩＩ，故不能设计更长的照射距离，亦不能设计气溶胶灭活实验，参考文献［１］刘国传，刘来福，张利峰，等．检验检疫病原微生物实验室的生物安全．检验检疫学刊，２００９，１９（３）：５０—５２．［２］陆兵，刘秋焕，王荣，等．结核分枝杆菌实验窀获得性感染事件分析．中国防痨杂志，２０１２，３４（５）：３３３—３３５．［３］陈明亭，万康林．结核病实验室技术手册．北京：科学出版社，２０１１’［４］ＺｗａｄｙｋＰＪｒ，ＤｏｗｎＪＡ，ＭｙｅｒｓＮ，ｅｔａ１．ＲｅｎｄｅｒｉｎｇｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｓａｆｅｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２（９）：２１４０—２１４６．［５］谢立新，金玉怀，张永红，等．影响紫外线杀菌的因素分析．华北煤炭医学院学报，２００５，７（３）：３７２—３７３．［６］阎邦首．紫外线对结核菌的杀菌效能．中国防痨杂志，１９６４，５（２）：４０９—４１１．［７］王黎霞，成诗明，何广学，等．中国结核感染控制标准操作程序．北京：人民卫生出版社，２０１２．［８］周维新．紫外线辐射强度与电压和距离的关系．中国消毒学杂志，１９９１，１０（４）：２３７—２３８．（收稿日期：２０１３—０６—０６）（本文编辑：薛爱华）用紫外线灭菌装置进行室内空气消毒时，房间内应保持清洁适当延长照射时问一７。消毒效果与距离成反向线性关系∞］。原微生物，对实验人员的健康构成严重威胁。本次紫外灭活这是本次实验的局限。