两种方法测红霉素的含量

业　２０１　３年第７期　两种方法测红霉素的含量　庞晓江，陈智慧　（新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，新疆　乌鲁木齐８３００６３）　摘要：以培养基Ⅲ号为试验用培养基，金黄色葡萄球菌为实验茵，将红霉素稀释成不同的浓度，寻找其呈直线相关的线性范围。建　立浊度法测定红霉素效价舍量的方法，并将浊度法测定的结果与管碟法测定结果相比较，无显著差异。浊度法具有简便、精确、快速的特　点，结果的精密度与准确度均较管碟法好，但浊度法也有其缺点。　关键词：浊度法；红霉素；含量测定；管碟法　中图分类号：￥８５３．７　文献标识码：Ｂ　２实验方法　２．１　金黄色葡萄球菌悬液的制备　取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营　文章编号：１　００３—４８８９（２０１　３）０７—００２４－０３　在国际上，抗生素效价测定以管碟法和比浊法并行，　比浊法具有耗时短、灵敏度高、操作简单、人为影响因素　少、测定结果准确度与精密度高的优点，２００５年版《中国　兽药典》开始收载比浊法。笔者对红霉索效价测定的浊度　法和管蝶法进行了相关实验。　养琼脂斜面上，在３５—３７℃培养２０　２２ｈ。临用时用灭菌水或　０．９％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。　２．２川号培养基的制备　胨５ｇ、葡萄糖１　ｇ、牛肉浸出粉１．５ｇ、磷酸氢二钾　３．６８ｇ、磷酸二氢钾１．３２ｇ、氯化钠３．５ｇ、酵母浸出粉３　ｇ、水　１　０００ｍｌ。　１　实验材料与仪器　１．１　实验材料　除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡　萄糖溶解后，摇匀，调节ｐＨ值使灭菌后为７．０～７．２，在ｌ　１５℃　灭菌３０ｍｉｎ。　金黄色葡萄球菌（ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３）、红霉素标准品　（批号０３４７－－９７０２，效价１　０１５ｕ／ｍｇ），均由中国药品生物　制品检定所提供；培养基Ⅲ、蛋白胨、牛肉浸出粉、酵母　浸出粉、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖。　１．２仪器　２。３　ｐＨ７．８磷酸盐缓冲液的制备　磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ　・３Ｈ２Ｏ）７．３３ｇ、磷酸二氢钾　０．４１ｇ、灭菌水１　０００ｍｌ。　２．４抗生素溶液的配制　精密称取标准品和原料药适量，￣ＩｌｐＨ７．８的磷酸盐缓冲　ＷＢＳ－１００￣生物比浊法测定仪、抑菌圈测量仪，由北京　先驱威锋技术开发公司提供；万分之一或十万分之一电子天　平；高压灭菌锅、恒温干燥箱；容量瓶、移液管、刻度吸管。　收稿日期：２（）１３一（Ｂ—ｌ１　液制成１　０００ｕ／ｍｌ的溶液（制剂产品按照管碟法制备方法进　行制备），再吸取１０ｍｌ　１　０００ｕ／ｍｌ的溶液到１００ｍｌ容量瓶中，　定容至刻度得１００ｕ／ｍｌ的溶液。用ｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液稀释　作者简介：庞晓汪（１９７３一），男，汉族，大专，从事兽药饲料检验工作。　大学，２００８．　【５ｌ　孟军．昭苏马场伊犁马杂交改良效果初步研究［Ｄ】．鸟鲁木齐：　新疆农业大学，２０１０．　『６　６】张慧林，李雪芹，张丽，等．奶牛前期泌乳性能与３０５Ｊ￣．产奶量　【２］　陈志远．高产乳牛饲养上应注意的几个问题Ｕ］．当代畜牧，　２０００，（３）：１４＂１５．　【３１　王建良．早期产奶性状与３０５天产奶量关系的探ｉ￣［Ｊ１．中国奶　的相关分析叭．黄牛杂志，２００２，２８（４）：１２．　荷斯坦奶牛最高日产和早期泌　【７】　谭世新，叶东东，热西提，等．乳性状与３０５天牛产奶量的相关分析Ⅱ】．新疆农业科学，２０１０，　４７（１２）：２　５０１￣２　５０４．　牛，１９９５，（５）：３５￣３６．　【４１　玛尔孜亚．于丽娟张艳花，等．新吉尔吉斯马种质特性研究报　告Ｕ】．中国草食动物科学，２０１２，３２（５）：８１￣８２．　ｏ　２０１３年第７期　到适宜的浓度。本品种可选择剂间比为１．５：１或２：１，抗　ｈ’Ｏ．６２ｌ７　生素最终浓度为１、１．５ｕ／ｍｌ或１、２ｕ／ｍｌ，该浓度可以根据培　养结束后吸收度大小在线性范围内进行调整。配制过程如　下：　分别精密量取１００ｕ／ｍｌ的溶液１．０Ｏｒａｌ和１．５Ｈｄ置于１００ｍｌ容　量瓶中，￣ＡｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成　浓度为１．００、１．５．００ｕ／ｍｌ的溶液。　．口：　Ｏ　Ｏ．２　Ｏ．‘　毒　２．５抗生素溶液的分装　图１　按照｝Ｅ浊法操作在Ｏ．８—３ｕ／ｍｌ内的线性　取高温灭菌的石英比色管１６支、分配ｄＳ１４支、ｄＳ２４　表１　范围实验中用的相应浓度溶液　支、ｄＴ１４支及ｄＴ２４支，分别作好标记，按照拉丁方顺序排　列。将标准品溶液ｄＳ１、ｄＳ２及供试品溶液ｄＴ１、ｄＴ２各１．００ｍｌ　按编号加入相应的大试管中。注意：加入溶液时，均在有　标记处沿管壁精密加入，以便在分装培养基时，可沿此处　管壁流人，将沾在管壁上的抗生素溶液冲入培养基内。　２．６培养基的接种　接种试验菌的量，需作预测试验，使高低剂量管经培　养后（３７℃，一般３～４ｈ１），吸收度Ａ在０．３—０．７。　２－７培养基的分装　取标准品适量，加ｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液制成１　０００ｕ／￣的溶　比浊法试验用的培养基，接种试验菌后用高温灭菌后　液。分别精密量取９．００ｍｌ、１０．００ｍｌ、１１．００ｍｌ　１　０００ｕ，Ｉｎｌ的溶　的大口吸管或其他自动加样器，分装至大试管中，每管分　液至ｌＯＯｍｌ的容量瓶中，用ｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液稀释至刻　装９．００ｍｌ，每管分装量应尽量一致，其差异愈小试验的精　度得￣９０ｕ］ｍｌ、１００ｕ／ｍｌ、１　１０ｕ／ｍｌ的溶液。　密度愈高。移人培养基时，按加入样品溶液的标记处稍上　分别精密量取１００ｕ／ｍｌ　１．Ｏ０、１．５０ｍｌ置于ｌＯ０ｍｌ容量瓶　方，沿管壁流人，立即振摇，使抗生素溶液与培养基混合　中，￣ｆｌＡｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成浓度　均匀。　为１、１．５Ｊ￣的溶液，作为实验用１００％标准品溶液。　２．８培养　分别精密量取９０ｕ／ｍｌ　１．００、１．５０ｍｌ置于１００ｍｌ容量瓶　使用ＷＢＳ一１０ｏ微生物比浊仪在３７℃培养２　ｈ。　中，￣ＡｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成浓度　２．９测量与计算　为０．９、１．３５　ｌ的溶液，作为实验用９０％标准品溶液。　使用ＷＢＳ一１００微生物比浊仪可进行恒温振荡培养并进　分别精密量取１　ｌＯｕ／ｍｌ　１．００、１．５０ｍｌ置于ｌＯＯｍｌ容量瓶　行在线快速测量，测量后能进行自动计算并产生实验报告。　中，￣ＵＡｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，配制成浓度　３实验结果　为１．１０、１．６５　ｎｌ的溶液，作为实验用１１０％标准品溶液。　３．１线性及其范围实验　实验结果：三点的总平均回收率为９９．９８％。　精密称取标准品适量（１　０１５ｕ／ａｒｇ），加灭菌水使溶　３．２．２精密度实验　解，￣ｆｌｐＨ７．８的磷酸盐缓冲液制成１　０００ｕ／￣的溶液，用ｐＨ７．８　３．２．３与管碟法的比较　的磷酸盐缓冲液稀释到下表中相应的浓度。按照比浊法操作　４讨论　在０．８～３　ｎ１内进行线性及其范围实验，结果如下图１、表１。　４．１　比浊法测定抗生素效价时抗生素溶液的浓度非常低，　结果分析：Ｒ＝０．９９８６，说明在Ｏ．８　３ｕ／ｍｌ的浓度范围内，　因此测定时所用的实验器具应严防抗生素残留和污染。　抗生素浓度的对数与吸收度成直线关系。　４．２微生物污染对比浊法测定效价有很大影响，若实验用　３－２准确度和精密度实验　器具、材料被微生物污染，将导致生物反应紊乱，各管形成　３＿２＿１回收率试验（自身对照法）　的吸收度精密度变差，可信限率显著增高，测定结果的精密　选择９０％、１００％、ｌ１０％三点进行回收率实验。精密称　度和准确度变差，因此，实验过程中应严防微生物污染。　业　４．３实验用菌种应保持新鲜、纯净，对抗生素反应应灵　敏。菌种对测定影响很大，若菌种不适合，将得不出正确　结果甚至得不出结果。若菌种不新鲜，其生长速度慢，在　养温度不均匀对结果的影响。　２０１　３年第７期　４．７培养时间不可过长，吸收度不可过高，高低剂量吸收　度达到０．３以上即可。若发现某种剂量下细菌生长缓慢或停　止生长应停止实验，否则测定结果变化较大。　规定时间内浊度（吸收度）达不到要求；若菌种不纯，各　管形成的吸收度精密度差，可信限率高；若菌种对抗生素　反应不灵敏，高低剂量抗生素形成的吸收度距离减小，测　定结果可信限率显著增高。　４．４实验用培养基的灵敏度应高，应严格控制培养基的ｐＨ　４．８菌悬液在培养过程中会有一定程度的下沉，致使上下　浊度不一致，将会影响吸收度的测定值，因此，在培养过　程中尤其是在测量前应进行一定程度的振摇，另外，振摇　可以增加培养基中的含氧量，加快细菌生长速度，缩短实　验时间。　值。若培养基的灵敏度不高或培养基的ｐＨ值不适合，细菌　生长速度慢，在规定时间内浊度（吸收度）达不到要求。　５小结　实验表明，浊度法测定红霉素效价具有明显优点，其　４．５配制、稀释抗生素溶液时应准确、精密；加入１．ＯＯｍｌ　抗生素溶液时应精密，从某一记号处加入，目的是用培养　基将粘在管壁的抗生素溶液冲下；加入９．ＯＯｍ］带菌培养基应　精密。　４．６培养温度应均匀，应按照随机排列的方式进行培养　操作方便、快速，结果准确，重现性好，可信限率低，培　养２～４ｈｌ￣ｐ可出结果，无扩散因素的影响，试验的灵敏度　高，结果的精密度与准确度均较琼脂扩散法为好，但采用　手工加样时，过程较为繁琐，对温度控制精度和温度均一　（二剂量法和三剂量法按照拉丁方排列），以消除局部培　性要求较高。　表１　回收率试验结果（用离剂量抗生素溶液计算｝　表２精密度实验结果　表３管碟法测定的实验结果