欣贝莱生物 | P450 单加氧酶到过氧化酶的功能转换
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发布时间：2025-01-30 07:06
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时间：2025-02-03 03:19
细胞色素 P450 酶（CYP）在合成精细化学品中扮演关键角色，包括天然产物、药物代谢物以及香料和香料化合物的合成。然而，CYP 使用烟酰胺辅因子的成本较高，且需要额外的电子转移蛋白，了其应用。为解决这一问题，研究团队尝试通过改造酶的氧活化机制，将CYP 转化为更高效的过氧化酶。该团队通过在 I 螺旋内的特定残基上进行修改，以使其更接近天然过氧化酶的残基，提高了过氧化酶的活性。构建了两个、四个、六个突变体，并发现两个突变体在较低浓度的过氧化氢（H2O2）下也能有效工作，将所有底物转化为产物，且立体选择性未发生变化。通过晶体结构分析，突变导致氧结合槽发生变化，这种方法适用于菌类固醇羟基化 CYP 和来自嗜热细菌的未表征的 CYP。研究成果发表在《ACS Catalysis》期刊，由 Stephen G. Bell 担任通讯作者。
为了进一步研究，该团队以细胞色素 P450 CYP199A4 作为模型系统进行了深入研究。CYP199A4 可以氧化 3,4-二甲氧基苯甲酸，生成香草酸。此外，CYP199A4 还能以高对映选择性催化此类反应。研究团队报道，通过将保守的活性位点苏氨酸残基突变为谷氨酸（T252E），可以将 CYP199A4 转化为过氧化酶。在使用 H2O2 作为氧化剂时，位置 252 的谷氨酸侧链可以充当酸碱催化剂，生成活性氧化剂。T252E 突变体在 H2O2 驱动的过氧化酶反应中表现出比野生型（WT）酶更高的产物生成效率（最高可达 6 倍）。该突变体对 H2O2 的亲和力也高于野生型酶，H2O2 KM 值提高了 6 倍。然而，该突变体需要进一步优化才能实际使用。
研究团队通过将 I 螺旋中的残基替换为来自 CYP255 家族酶的残基，改变构成 CYP199A4 氧结合槽的残基序列，使其更接近 GcoA 的序列，以探究这是否会导致过氧化酶活性增强。研究提出了在 CYP199A4 中用 Q 替换 D251 并用 E 替换 T252 的双突变体将提高过氧化酶活性。还研究了四重突变体，将 248AGLDT252 残基替换为 GALQE，以及用 GALQEPG 残基替换序列 248AGLDTTV254 的突变体。
通过对 CYP199A4 的 QE、GALQE 和 GALQEPG 突变体进行光谱分析，构建了 CYP199A4 的 GALQEPG 突变体并纯化了突变体蛋白。紫外可见吸收光谱评估了 QE 和 GALQE 突变体的高纯度，而 GALQEPG 突变体的 Soret 带 λ max 为 421 nm，仅能少量生产，酶相对不纯（Rz ≈ 0.2）。这表明替换 CYP199A4 I 螺旋的这一部分损害了 CYP199A4 掺入血红素和/或折叠的能力。
通过硫酸钠还原生成亚铁形式，然后用一氧化碳处理，观察 Soret 带的移动，判断这些突变体都正确折叠并具有 CYP 酶的功能。在 QE 酶中添加 4-甲氧基苯甲酸会引起 UV−vis 吸光度的变化，对应于从低自旋（LS）到高自旋（HS）的 < 5% 自旋态转变。GALQE 突变体的红移 Soret 带可能是由于 E252 羧酸根基团与血红素水配体更强的相互作用所致，或者谷氨酸残基可以直接与血红素铁配位作为第六轴向配体。结果表明，向 QE 和 GALQE 突变体中添加对位取代的苯甲酸底物对自旋态平衡的扰动最小，这意味着血红素环境可能与 T252E 突变体比 WT CYP199A4 更相似。
这些突变体在底物结合时不会转化为 HS 形式，因此预计这些酶在 NADH/O2 支持的反应中活性较低。为了评估这些突变体是否可以通过正常的 CYP 单加氧酶催化循环进行反应，以电子转移伴侣蛋白和 4-甲氧基苯甲酸为底物，对 QE、GALQE 和 GALQEPG 突变体进行体外 NADH 支持的反应。WT 快速将该底物去甲基化（生成 4 羟基苯甲酸），还原当量与代谢物形成的偶联效率几乎为 100%。在存在 4-甲氧基苯甲酸的情况下，QE、GALQE 和 GALQEPG 突变体的 NADH 消耗率与不存在底物时的泄漏率相同，体外反应混合物的 HPLC 分析显示产物形成水平极低。因此，这些酶都不能通过单加氧酶催化循环有效运作。
接下来，评估了 CYP199A4 突变体对过氧化氢的稳定性。结果显示，底物的存在可以保护 T252E 突变体的血红素在暴露于 H2O2 时免遭破坏。使用 T252E、QE、GALQE 和 GALQEPG CYP199A4 进行血红素漂白实验，比较了这些突变体暴露于 60 mM H2O2 时的稳定性。在 1 mM 底物（4-甲氧基苯甲酸）存在下，T252E 突变体以最慢的速率（0.027 μM min−1）漂白，而 GALQEPG 突变体被破坏最快（分别为 0.155 和 1.87 μM min−1）。总体而言，这些结果表明 T252E 突变体对 H2O2 具有最高的稳定性，而 GALQEPG 突变体具有最低的 H2O2 耐受性。
通过使用 50 mM H2O2 测试过氧化酶活性，发现 T252E 突变体产生 353 ± 8 μM 产物，而 GALQEPG 突变体仅产生 96 ± 4 μM 产物，并在反应的前 20 分钟内被 H2O2 灭活。使用不同浓度的 H2O2（5、10、25 和 50 mM）优化反应，实验表明，T252E 和 QE 突变体对 H2O2 的亲和力也显著更高。在 4 小时内，T252E 和 QE 突变体比 WT 和 GALQE 变体产生更多量的产物。重要的是，当使用较低浓度的 H2O2 时，QE 突变体在 4 小时后仍然具有活性，这表明进一步优化可以带来更高的产物产量。
对于 4-乙烯基苯甲酸的对映选择性环氧化，实验显示 QE 和 GALQE 突变体也能够将 4-乙烯基苯甲酸转化为正确的环氧化物，主要产生 (S)-环氧化物 (≥84% ee)。通过使用 (S) 和 (R)-环氧化物的真实样品进行共洗脱实验，确认主要对映体为 (S)-对映体。延长反应时间后，出现更多的进一步氧化代谢物，但估计 QE 和 GALQE 突变体均产生~600 μM 环氧化物。
研究中，使用先前报道的条件将 QE 和 GALQE 突变体与 4-甲氧基苯甲酸共结晶并收集衍射数据。结构数据揭示了该水配体与 QE 突变体中的血红素的结合较弱，且 E252 羧酸酯与 A248 (2.6 Å) 和 W151 (2.5 Å) 的羰基形成氢键。与 T252E 突变体相比，QE 突变体的 I 螺旋结构发生变化，I 螺旋槽更宽，允许额外的水分子 (W166) 结合其中。在 GALQE 突变体中，血红素结合的水配体与 E252 羧酸盐形成额外的相互作用，并改变了氧结合槽的结构。
此外，该团队选择了细菌种类 CYP154C8，它可以区域和立体选择性地将孕酮氧化为 16α-羟基孕酮。通过单突变 T258E，已经证明 CYP154C8 酶具有过氧化酶活性。生产并纯化了 CYP154C8 的 GAHQEPG 变体，该突变体以良好的产率产生，表明这些氨基酸取代可以并入该酶中。黄体酮可以与这种突变酶结合，改变 Soret 波段紫外可见吸收光谱，并将其转化为单一产物，与 16α-羟基黄体酮共洗脱。虽然单突变体 T258E 在使用 20−40 mM H2O2 时具有最佳活性，但 GAHQEPG 突变体在低得多的 H2O2 浓度下也能有效发挥作用（使用 5−10 mM H2O2 时产生相似水平的羟基化代谢物），且保持了反应的立体选择性和区域选择性。
研究团队还评估了将过氧合酶活性引入尚未表征的 CYP 酶中，从嗜热细菌 Thermosporothrix hazakensis（CYP102）中选择了一种 CYP102 酶，其功能未知，但可能与脂肪酸羟基化 CYP102A1（P450BM3）有关。获得并评估了编码该酶血红素结构域 QE 突变体的基因 CYP102 酶与十六烯酸（棕榈酸）的过氧化酶活性。在开始反应之前，CYP102 HazakQE 突变体能够耐受 50°C 加热 30 分钟。通过替换氧结合槽周围的残基，将细胞色素 P450 单加氧酶转化为过加氧酶，同时保持所需活性、高区域选择性和立体选择性，这种方法有效提高了 CYP 酶在复杂氧化反应中的实际应用。这将这些酶转化为有价值的生物催化剂，使用廉价的 H2O2 进行操作，产生有价值的合成代谢物，如药物代谢物、药品以及香料和香料分子。
