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转化过程的第一步是将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上,然后将这些质粒导入农杆菌中,最终通过农杆菌将目的基因导入植物细胞。接下来,目的基因会整合到植物染色体的DNA上,并在此后实现稳定维持和表达。
获取目的基因的过程包括使用性核酸内切酶切割下所需片段,构建基因表达载体则需要将目的基因与载体(通常为质粒)通过DNA连接酶连接。随后,使用农杆菌作为载体将含有目的基因的重组质粒导入受体细胞中。
检测与鉴定步骤涉及多种方法,如DNA分子杂交、抗原-抗体杂交或个体生物学水平鉴定。如果需要,可以将重组后的细胞导入植物体内进行更详细的个体生物学水平检验。
整个转基因体系建立的基本步骤包括:构建目的载体,将载体转化至农杆菌中,使农杆菌与植物共培养,筛选转化植株,以及鉴定转化植株。每一步骤中都有其独特的方法和技术。
目的载体构建涉及到目的基因的克隆、载体的酶切与连接,以及测序分析。农杆菌转化通常需要热激和冷激,农杆菌与植物共培养时,添加促进愈伤生长的激素有助于提高转化率。
转化植株的筛选多采用抗生素方法,抗生素的选择依据目的载体来定,可通过不同浓度的抗生素筛选。转化植株的鉴定通常使用PCR技术。
所有操作必须在无菌条件下进行,无菌是植物组织培养中不可或缺的重要因素。